Российские ученые разработали новый метод тестирования эффективности антибиотиков

Ученые МГУ имени М. В. Ломоносова совместно с колегами создали надежный и приемлемый по затратам высокопроизводительный механизм, позволяющий ускорять и улучшать поиск новых антимикробных препаратов.

Ими создана система, не только измеряющая активность микробов, но и одновременно детектирующая антимикробные вещества, которые останавливают рибосомы и запуск SOS-ответа на повреждения ДНК. Результаты опубликованы в журнале Antimicrobial Agents and Chemotherapy. Ведущий автор исследования — Илья Остерман, лауреат правительственной премии РФ в области науки и техники для молодых учёных за 2016 год, научный сотрудник химического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова.

Бактерии постоянно вырабатывают резистентность к антибиотикам, поэтому человечество вынуждено проводить последние десятилетия в поисках все новых и новых веществ, позволяющих решить эту проблему. Главным методом поиска является высокопроизводительный скрининг — испытание огромного количества веществ, как из химических библиотек, так и новых природных соединений, с помощью скаффолдов (групп клеток, культивируемых подложках-носителях). Для увеличения эффективности методики необходимо искать пути снижения стоимости реагентов, автоматизации процесса и уменьшения количества стадий этой работы.

Уже сейчас существуют штаммы широкого спектра, которые помогают определять активность разных видов антибиотиков. Комбинация этих штаммов могла бы дать большую выгоду, ускорив процесс поиска нужных соединений и понимания механизмов их работы, но это требует множества проверок каждого вещества. Ученые сталкиваются с дилеммой: проверять одновременно много веществ по одному признаку, или много признаков одного вещества, чтобы понять, на что же оно воздействует. Оба пути несовершенны, но российские ученые попытались найти компромисс, использовав плюсы обоих подходов.

«Нами был разработан подход, позволяющий in vivo определять механизм действия новых потенциальных антибактериальных препаратов, одновременно с определением эффективности, — сообщает автор исследования Илья Остерман — Благодаря автоматизации метода было возможно анализировать тысячи соединений в день».

Созданная репортерная система (в молекулярной биологии так называют вставленные в организм гены-репортеры или маркеры, которые помогают измерять, насколько активно работают другие гены) основана на гене, кодирующем белок rfp (красный флуоресцентный белок). Этот ген, называемый Katushka2S, был вставлен таким образом, чтобы начинать работать во время SOS-ответа — реакции клетки на стрессовые, неблагоприятные условия, требующие повышенной внимательности со стороны систем ремонта повреждений ДНК. По замыслу ученых, этот процесс должен был запускать синтез красного флуоресцентного белка, который, как предупреждающая красная лампочка, может оповещать о том, что в бактериальной клетке что-то пошло не так. Чем больше будет красного света, тем сильнее действует антибиотик.

Как собрать такую репортерную систему? Для этого ученые поместили ген Katushka2S сразу же после промотора (области, с которой рибосома, главный органоид белкового синтеза, идя по цепи, узнает старт последовательности, где записан белок) гена sulA, запускающегося на поздних стадиях SOS-ответа и подавляющего клеточное деление. Таким образом, как только ген sulA начинает работать, с ним в связке тут же начинает синтезироваться и красный флуоресцентный белок. Интересно, что цвет также имеет значение: именно белок rfp светит в том диапазоне (дальне-красного цвета), который довольно хорошо пропускают ткани человека.

При этом генетический код начала гена sulA был изменен таким образом, чтобы вставка гена Katushka2S не повлияла на вторичную структуру белка, которая позволяет ему выполнять свою функцию.

«На первом этапе была создана генно-инженерная конструкция с использование двух флуоресцентных белков, экспрессия первого зависела от присутствия ингибиторов синтеза белка, а второго от присутствия ингибиторов синтеза ДНК. Затем при помощи гиперчувствительного штамма кишечной палочки был создан репортер для детекции соответствующих типов антибиотиков», — рассказывает Илья Андреевич о своей работе.

Каким же был второй флуоресцентный белок? Им стал голубой флуоресцентный белок CER, который работал по похожему механизму, только являлся маркером для остановки трансляции — синтеза белков, и свет его можно было увидеть, если производство белка застопорилось из-за остановки следования рибосом по цепи РНК.

Эта система двух репортеров уже была протестирована на выяснении активности нового антибиотика амикоумацина, для которого ранее не была известна мишень, которую он поражает, а также ряда других антибиотиков.

«Уже сейчас при помощи данного подхода нами проанализировано более пятидесяти тысяч соединений, обнаружены новые ингибиторы синтеза белка и синтеза ДНК, которые в дальнейшем могут стать основой для новых антимикробных лекарств. Процесс скрининга также будет продолжаться» — заключил ведущий автор исследования Илья Остерман.